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  • 什么是顯微鏡綜合調節對比(IMC)?

    2016-04-11技術資料

    霍夫曼調制對比已經確立了自己作為觀察未染色,低對比度生物標本的標準。其創新的技術實施許可顯著簡單的處理和更大的靈活性。在現代倒置顯微鏡的光路調制器的集成允許使用范圍廣泛的明場或載物臺的物鏡,而不是一小部分的特殊物鏡。現在,對比度可以修改和優化的單獨使用自由接近調制器。

    調節對比度

    調節對比度是對比度增強的寬視場顯微鏡可以轉換在未染色標本和活細胞光學梯度或斜坡入不同的光強度的方法。它是在1975年發明了由羅伯特·霍夫曼和采用狹縫板,使斜照明和調制器,用于光強度調制。由于樣品的三維外觀,在醫學和生命科學的調節對比度的主要應用是類似ICSI和顯微技術(胞漿內單精子注射)在IVF克隆和原核注射轉基因。

    在光路徑中的特殊成分

    在光路中的至少兩個特殊的部件所必需的調節對比度的照明。以使斜光的狹縫板放置在聚光鏡的前焦平面。其次,調制器被放置在物鏡的后焦平面。調制器包含具有不同的光密度三個指定區域:一個透明區,一個具有15%的光的權限和一個用1%的光的權限。光通過調制器是通過定義所謂的調制。

    除了上述組分含有偏振片的第二狹縫通常可以在滑動板中找到。在與位于顯微鏡的聚光鏡的頂部,另一個偏振片組合,該偏振片可以用于控制有效狹縫開口(通過打開90°(暗)的位置),并啟用緩解的效果。需要注意的是檢體未允許的雙折射塑料或玻璃容器雇傭的偏振器之間的位置。然而,偏振片不是調制對比度的先決條件。

    徠卡顯微鏡什么是綜合調節對比(IMC)?

    圖1:從聚光鏡光通過該狹縫板的狹縫,以使偏斜照明。當光通過樣品,這是在相變偏轉(例如改變細胞膜的斜率)。隨后,光被偏轉到調制器產生一個浮雕狀,三維圖像的印象的不透明或透明的部件。?

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    徠卡顯微鏡什么是綜合調節對比(IMC)?

    圖2:當光通過它被調制在幅度調制器的不同區域。通常該區域具有(左到右)的1%,15%或100%的傳輸。

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    調制相差梯度轉換成亮度漸變

    細胞的許多部件導致通過固有特性的改變透射光的相位。這些性能可能是斜率和特定結構的陡度,獲得修改折射率變化率或僅僅改變在給定結構的厚度的結構。由于這些性質(如單元厚度)通常在一定面積逐漸變化(而不是立即改變),光的相位的過這方面的變化也發生逐漸導致相位梯度。相梯度將衍射入射光引起的光的偏轉角的變化。

    由于所采用的調制相反的偏斜照明,在偏轉的角度的變化可能大大受到影響,光將通過調制器在不同的區域相比,非偏轉的光。在小區(s)表示,都或多或少均勻的斜率,陡度,厚度等的圈所產生的圖像的區域將顯示為灰色。同樣情況也適用于圖象的背景,因為光通過這些同質區域不會經歷相移由于在檢體相梯度和幾乎不被偏轉。(奧林巴斯顯微鏡)

    在一個調制對比度系統的非偏轉的光通過在用15%的光的權限的調制器的面積,導致灰的顏色為細胞(S)和背景的均質區域。當光通過引起的相移(例如改變細胞膜的斜率)的試樣的區域中,光被偏轉或者黑暗(1%許可)或調制器的透明(100%許可)的區域。作為試件是傾斜地照亮,該圖像將出現從梯度從梯度的另一側(在光被偏轉到區域與(其中光被偏轉到區域用1%許可)和亮的一側較深100%的許可)。

    徠卡顯微鏡什么是綜合調節對比(IMC)?徠卡顯微鏡什么是綜合調節對比(IMC)?

    圖3A,B:通過將相梯度為亮度梯度調節對比度可視化的透明,低對比度的標本。其結果是,高對比度的灰度級形成的創建三維圖像的印象。(圖3a禮貌C. Mehnert的,體外授精中心,德國吉森)

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    IMC提供了更多的自由

    在綜合調制對比度的情況下(IMC)的調制器的物鏡以外的焦平面共軛到所述聚光鏡(中間光瞳)的光束路徑(圖4)結合起來。調制器被安裝在其上分別插入在支架上(圖5)一側的瞳孔間接口滑塊。因此,它們是自由訪問,并允許用戶根據需要很容易地調節對比度。?除此之外,也可以使用調制器,具有不同的傳輸。滑塊還設有用于調制的圖像的位置明。用顯微鏡法團校董會已成立,以確保對比度(3D印象的影子方向)的方向是相同的所有物鏡。?檢體的空間印象改變物鏡或放大倍數時因而保持不變,因此沒有必要調整狹縫狀光闌。

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    圖4:在徠卡的數碼倒置顯微鏡IMC解決方案。該調制器可自由在中間光瞳為靈活調整物鏡外部訪問和定位的。狹縫狀光闌定位在聚光鏡瞳孔。

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    徠卡顯微鏡什么是綜合調節對比(IMC)?

    圖5:IMC滑塊與在兩個不同的光瞳位置調制器的光盤是容易使用,并允許單獨調整。

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    脫開的調制器時的一個基本的考慮是,在物鏡的后焦平面可以是45毫米齊焦距離的整個范圍內的任何地方。因此,物鏡的外部的調制器必須是可移動的至少該距離。多虧的徠卡物鏡,這是由固定焦平面,部署在倒置顯微鏡和固定倍率步驟從5倍定義為63X的設計,有可能減少調制平面數兩個瞳孔的位置(圖6)。

    光束路徑的瞳孔,在所謂的中間光瞳的圖像,被設計成一個1×望遠鏡系統。物鏡背后的無限光路轉載于中間的瞳孔。其結果是,平面平行的光的任何厚度的調節劑,也可以插入到在中間光瞳的光束路徑,傾斜或未傾斜,而不損害圖像的位置或質量。雜散和虛光由望遠鏡系統的最優單色和彩色校正以及IMC調制器的汽相淀積灰色和暗金屬涂層的極低反射特性最小化。

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    圖6:徠卡物鏡是通過固定的焦平面定義。由于它們在倒置顯微鏡和由于固定倍率步驟五倍63X的使用,有可能減少調制平面數兩個瞳孔的位置。

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    獨立可變參數

    法團校董會提供充足的空間用于調制對比度個別調整。該調制器是垂直可調,以提供均勻的圖像在任何時候。不同階段或緩沖溶液的水平,并在檢體盤的細胞的不同位置因此可以補償。移動調制器橫盤改變分辨率:進一步調制器和狹縫隔膜向外移動,更高的分辨率(最大分辨率RES =λ 2NA)。

    兩個調制器參數影響的對比度的強度:發送和灰色區的寬度。?降低傳輸增加對比度。?的25%的傳輸,例如,導致在光滑對比度。?具有大約10%的值時,對比度變顯著更清晰。?改變調制器的寬度也同樣有效(圖7)。

    徠卡顯微鏡什么是綜合調節對比(IMC)?

    圖7:橫向可調調制器可變分辨率,裂隙隔膜額外的極化狹縫可調的浮雕效果。

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    縮小灰色區域的結果更清晰的對比,而寬調制器柔化整體形象的印象。法團校董會的狹縫隔膜有兩個開口。第一狹縫上成像的調制器的灰色區域,產生用于調制對比度的偏斜照明。?第二狹縫覆蓋有偏振箔(圖7)。可旋轉的偏振器定位在膜片的前面可以增加或減少的調制對比度3D效果。?用塑料盤工作時,由于光只偏振光在照明側并沒有分析器上使用物鏡側偏振片不影響圖像質量。狹縫隔膜的尺寸相匹配的最常用的聚光鏡。

    因此IMC不僅適用于生物材料的常規檢查 - 這也是一個很好的工具,為要求苛刻的應用,如顯微操作,顯微注射或顯微解剖。

    IMC的優點

    眾多優勢使綜合調節對比度的寬視場顯微鏡一個廣泛使用的方法。?綜合調節對比度可與放大倍數高達63X的物鏡使用。不需要特殊的物鏡,并具有較高的校正(如平場消色差和復消色差物鏡)的物鏡可以用于調制對比度。這使得優秀的具有良好的對比度和細節的可視性解決

    調節對比度顯微鏡觀察的另一個優點是,不像在微分干涉顯微鏡,塑料器皿和培養皿器具可以使用,如在光路中的偏振器位于所述樣品之前。此外不需要沃拉斯頓棱鏡。這導致對裝有調節對比度顯微鏡適中的成本。

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