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  • 徠卡顯微鏡低溫熒光顯微鏡與低溫電子顯微鏡組合

    2016-05-03新聞資訊

    許多生物的見解可以通過組合熒光顯微鏡(FM)與電子顯微鏡(EM)的力量來研究同一樣品獲得 - 這就是所謂的相關光學和電子顯微鏡(CLEM)。?在FM,特異性蛋白可被標記和識別,并且其動態和交互可以在固定或活細胞可視化。在EM中,充分的環境的上下文中可以看出,能夠得到高分辨率的細節。在這篇文章中,我們介紹CLEM的理念,特別注重對低溫CLEM:低溫FM與冷凍EM的組合。

    熒光和電子顯微鏡的局限性

    當研究在細胞內或在分子間的相互作用的水平的生物事件,科學家經常被調頻的空間分辨率的限制。所謂的“超級分辨率”的方法大大有助于克服這種限制,以允許單個熒光標記的,其分辨率達幾十納米的本地化某種方式。調頻也是有限的,因為它僅視像化的熒光標記物,并沒有提供關于在此標記被觀察到的結構和形態學的上下文信息。該第二限制也可以是一個優點,因為它提供的特異性,從而允許標記的分子在一個致密的海未標記的分子來鑒定。

    相反,觀察具體的標記分子,EM形象化的電子密度的地方差異。這使它成為理想的技術來分析大分子復合物的結構或描述細胞形態和環境。在EM中,但是,它難以直接區分特定類型的分子。在CLEM實驗,調頻和EM都進行了同樣的樣品,以從調頻鏈接特定的或動態的信息,具有高分辨率或自EM的環境信息。

    為TEM和低溫EM樣品制備

    理解CLEM的挑戰,有必要檢討了EM樣品的性質。?在透射電子顯微鏡(TEM),電子束照射的樣品和投影圖像被記錄。當A投射到試樣,被加速的電子相互作用和被吸收或散射。樣品需要足夠薄的電子束穿過樣品。由于存在于顯微鏡柱的真空,樣品也需要在干燥,固體狀態下它們不會立即分散到真空將被成像。

    生物標本用于TEM中最常見的制備方法是按順序更換所有的水樣品通過醇,然后嵌入與被聚合的樹脂,從而產生固體塊。此塊然后用切片機,得到切片的TEM成像足夠薄切片。以提高對EM圖像的信號和對比度,可樣品制備過程中加入電子致密材料,例如重金屬染色。

    用于樣品制備的替代的可能性是迅速凍結的樣品玻璃化所有包含的水。?這可以通過快速切入含薄標本為液化天然氣,如乙烷網格或通過使用高壓冷凍裝置,隨后冷凍切片來實現。這種技術的好處是,樣品保持水合以緊密到天然狀態和其分子結構被最佳保留。?由此產生的“低溫的樣品”可以然后在EM成像(這是冷凍EM),只要它們保持在任何時候都在溫度接近液氮。(奧林巴斯顯微鏡)

    在冷凍的EM圖像對比度的效果僅由在生物分子和周圍的冰之間的電子密度的差異。因此,該圖像包括對樣品的分子結構的信息。冷凍EM可以達到<5納米單個圖像分辨率。當與計算的平均方法相結合,所關心的蛋白質的結構可以在最好的情況下得到解決,以0.3納米的分辨率。

    兩種方法CLEM

    取決于所使用的EM樣品制劑的類型,并且取決于調頻的類型而進行的,人們可以使用不同的CLEM方式。一種方法是進行活細胞熒光成像制備樣品用于后續EM之前。這使得在FM和EM觀察狀態之間至少幾秒鐘一個典型的時間間隔,由于同時固定或固定化樣品損失的時間。因此,這種策略并不理想,研究快速移動過程或信號非常精確的定位。第二種方法是,既發揮EM和FM在相同的樣品,一旦它已準備EM。此過程提供高相關性的精度。這第二種方法可應用于嵌入在特定的條件下樹脂樣品。它也可以適用于冷凍樣品 - 這是低溫CLEM。

    挑戰和低溫CLEM要求

    冷凍CLEM的特殊挑戰是必須保持樣品溫度低于-140℃的任何時候,以避免形成晶體的冰,并且該樣品不能暴露于濕度,以避免水的凝結。這些條件必須保持在所有階段,包括調頻中,并同時將所述樣品制備設備,熒光顯微鏡,及冷凍EM裝有TEM之間的樣品。

    冷凍的CLEM需要配用特殊的冷凍階段在成像期間保持低樣品溫度熒光顯微鏡。在冷凍階段,必須將試樣的污染引起的環境濕度結霜最小化。一個理想的系統的光學性能應使高分辨率成像靈敏度高,以允許高精度的相關性。

    許多低溫階段和相關的工作流已經開發了用于冷凍CLEM。這些包括反轉配置,其中所述顯微鏡物鏡從樣品通過載玻片分開,以及使用長工作距離的物鏡直立設置。我們利用一個堂堂正正的顯微鏡配置和冷卻的物鏡面前,讓我們的冷凍FM設置采用高NA物鏡,用短的工作距離,同時保持陶瓷成功冷凍CLEM標本。

    工作與我們原來的設置,在描述提供了經驗促成了徠卡EM冷凍CLEM解決方案(圖1)的開發。這種解決方案使得能夠以更可靠的和直觀的方式進行冷凍CLEM。

    徠卡顯微鏡低溫熒光顯微鏡與低溫電子顯微鏡組合

    圖1:徠卡EM低溫CLEM系統。

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    為什么冷凍CLEM這樣有用嗎?

    冷凍CLEM使我們能夠找出感興趣的生物對象(這可能是動態的,罕見的,或以其它方式難以找到),根據它們的熒光信號。?然后,我們可以找到非常相同的對象,將獲得的高分辨率結構數據,在上下文中,通過冷凍EM(圖2)。?在許多情況下,這樣的信息不能以任何其他方式來獲得。

    徠卡顯微鏡低溫熒光顯微鏡與低溫電子顯微鏡組合

    圖2:A)低溫FM一個GFP標記噬菌體的圖像(圓圈白色)。?標記為黃色多色信號從熒光微球起源。B)的樣品的相同部分的低溫EM概覽圖像。標記A中的微球再次標記為黃色。它們的位置用于定位所述熒光噬菌體的坐標中的冷凍的EM圖像。?C)高倍率冷凍EM圖像的識別坐標。?圓圈指示信號,其內的噬菌體被看見的預測起源。

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